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實(shí)驗(yàn)試劑

樣品提取液（8M尿素、2％非離子型去污劑NP－40、2％Ampholin，pH3.5-10、2％DTT）

膠母液 （30％的29/1的Acr/Bis），兩性電解質(zhì)

陽極緩沖液 1M磷酸

陰極緩沖液 1M氫氧化鈉

固定液（10％的三氯乙酸、1％的磺基水楊酸）

染色液（35％乙醇、10％冰醋酸、0.15%考馬氏亮藍(lán)R250）

脫色液（35％乙醇、10％冰醋酸）

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高壓電泳儀、IEF槽、離心機(jī)等

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣品提取

   1) 1ml原核表達(dá)細(xì)胞液離心取沉淀

   2) 沉淀用100ulIEF樣品緩沖液裂解，離心取上清

2. 制膠

   1) 安裝超薄膠裝置

   2) 依次加入下述試劑

            膠母液             2ml

            尿素               8M    /脫氣

            NP－40            0.2ml

            兩性電解質(zhì)         2ml

            10%過硫酸胺       50ul

            TEMED             5ul

   3) 倒膠

3. 電泳

   1) 預(yù)電泳膠凝固后，拆卸制膠裝置，將膠連同支持膜一起置于水平電泳槽上（要求，電泳槽面板上首先被液體石蠟浸潤，在凝膠支持膜與電泳槽面板間無氣泡）。

   2) 將分別被陰陽極緩沖液浸潤的電極條置于膠面上將與陰陽電極接觸的部位，蓋上電泳槽罩子，連通電源，200V預(yù)電泳10min。

   3) 電泳，將薄棉紙剪成小塊，輕輕置于預(yù)備點(diǎn)樣的膠面上，取10－15ul樣品液，點(diǎn)于薄棉紙上，蓋上罩子，連通電源進(jìn)行電泳

   4) 電泳參數(shù)

    200V 30min，400V 30min，800V4hr

4. 染色

   1) 固定，將電泳完的膠連同支持膜放置于固定液中，10min.

   2) 顯色，50℃下，將膠與支持膜放置于染色液中，顯色，直至條帶出現(xiàn)。